一、实验准备

本实验使用wako质谱级赖氨酰肽链内切酶125-05061，旨在为后续的质谱分析做准备。确保一切仪器设备和试剂均符合实验要求，以提高实验的准确性和有效性。

二、酰胺酶单位的定义

酰胺酶单位是指在30℃、pH 9.5条件下，每分钟能够产生1μmol对硝基苯胺的酶量。其计算公式为：

AU/vial = [(a-b)/25] × (1/962) × (40/01)

其中，a为检测样品中的吸光度，b为空白对照中的吸光度。

三、实验操作流程

本实验遵循以下步骤，以确保样品不受污染并准确进行质谱分析：

1. 使用聚硅酮处理的微量离心管及吸管，防止捕获任何蛋白质。
2. 运用质谱分析专用的凝胶染色试剂盒，例如银染剂MS试剂盒（产品编号：299-58901）和负凝胶染色MS试剂盒（产品编号：293-57701）。
3. 对蛋白质样品进行电泳分离。
4. 从凝胶中切割蛋白质片段并放入微量离心管中。
5. 使用质谱分析用凝胶染色试剂盒中的脱色溶液对凝胶进行脱色处理。
6. 向管中加入300μL乙腈，并在搅拌器中振荡30分钟。
7. 去除乙腈，使用Parafilm膜覆盖微量离心管。
8. 在Parafilm膜上打孔，并进行真空干燥15分钟。
9. 使用100μL 10mmol/L DTT溶解在100mmol/L碳酸氢铵中，56℃恒温处理1小时。
10. 室温冷却后，使用50mM碘乙酰胺溶于100mmol/L碳酸氢铵进行恒温处理，暗处维持45分钟并进行涡旋。
11. 用100μL 100mmol/L碳酸氢铵洗涤凝胶片段，持续10分钟。
12. 用300μL乙腈对凝胶片段进行干燥处理15分钟。
13. 使用100μL 100mmol/L碳酸氢铵对凝胶片段进行膨胀处理15分钟。
14. 再次用300μL乙腈干燥凝胶片段，持续15分钟。
15. 去除液相，并进行真空干燥15分钟。
16. 用100μL赖氨酸内切酶溶液在冰水浴中膨胀凝胶片段，持续45分钟。
17. 去除100μL赖氨酸内切酶溶液，将凝胶片段放入37℃、10μL 50mmol/L Tris-HCl pH 8.5环境中过夜。
18. 向凝胶片段加入50μL 20mmol/L碳酸氢铵，振荡以进行多肽提取3次。
19. 加入5%甲酸/50%乙腈，振荡凝胶片段进行多肽提取3次。
20. 如有需要，使用SpeedVac浓缩多肽。
21. 使用ZipTip进行多肽的脱盐和纯化。
22. 如有需要，可用弱真空浓缩多肽至2μL。
23. 最后，加入基质以进行质谱分析。

四、购买渠道

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