人生就是博-尊龙凯时提供高品质的细胞培养解决方案，以下是细胞培养及传代的基本步骤和注意事项。

培养条件

细胞培养所需的条件为DMEM培养基（10% FBS和1% P/S），适用于贴壁细胞的生长。培养温度应保持在37℃。

传代方法

建议首次传代比例为1:2，若细胞状态良好，推荐在2天后进行液体更换。为确保最佳细胞质量，建议同时购买细胞，享受优惠。

细胞处理

收到细胞后，请使用75%的酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后置于超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行处理。

显微镜观察

定期使用显微镜观察细胞生长情况并拍照保存，建议分别拍摄40x、100x及200x放大倍数的照片，前三天的照片尤为重要，作为售后依据，未拍照则视为收到状态良好。

细胞培养步骤

a. 贴壁细胞传代

1. 若细胞未超过80%的汇合度，将培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，并放入37℃、5% CO2的孵箱中培养。若细胞密度超过80%，可直接进行传代。

2. 轻弃培养液，使用不含钙和镁的PBS润洗细胞1-2次。

3. 添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，并观察细胞状态；若大部分细胞变圆并脱落，迅速轻敲培养瓶，再加入5ml以上的完全培养基以终止消化。

4. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，于1000RPM下离心5分钟，弃去上清液后，加1-2ml完全培养基重悬细胞。

5. 依据比例1:2进行分瓶传代（分配至两个T25瓶中），添加新的完全培养基至5-8ml/瓶，然后放入37℃、5% CO2培养箱继续培养。

b. 悬浮细胞传代

1. 采用半换液法：将培养瓶竖立于培养箱中静置约1小时，吸去3ml培养基，补充相同体积的完全培养基。如培养基变色缓慢，可直接加入约500µl FBS。传代时可直接补给5ml培养基，分两个培养瓶。此外，若细胞狀況不佳，建议进行离心处理。

2. 离心换液法：需分瓶时，将细胞悬液收集至离心管中，以1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养基后重悬混匀。然后将悬液按1:2比例分到新的T25瓶中，加入6-8ml已配置的完全培养基，以保持细胞生长活力。后续传代可根据细胞状态调节比例至1:2至1:5。

细胞冻存与复苏

c. 细胞冻存

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。

2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞状态，待细胞呈现圆形后加入5ml完全培养液以终止消化，再轻轻吹打细胞使之脱落，将悬液转移至15ml离心管中，并于1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清液后，加入1ml无血清冻存液（货号：C7001），混匀并转移至冻存管中。

4. 将冻存细胞迅速放入-80℃冰箱保存，若后续需转移至液氮罐，需在-80℃保存至少24小时再进行转移。

d. 细胞复苏

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），快速放入37℃水浴中解冻，直到冻存管内无冰晶，再用75%酒精擦拭管外壁。

2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清液后，用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，并在37℃、5% CO2培养箱中培养。

4. 次日更换新鲜完全培养基继续培养。

注意事项

在运输过程中，某些细胞可能会因粘附不牢而脱落。这是正常现象。如果有较多细胞脱落，可将培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集沉淀并加入胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后转入完全培养基终止反应。随后离心、弃上清后重悬并以1:2比例分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml每瓶，再放入37℃、5% CO2培养箱继续培养。

通过人生就是博-尊龙凯时的细胞培养指导，确保您的细胞培养过程高效安全，促进科学研究和医疗应用的进展。